Auteurs : Emmanuelle FRANCOIS et Maurice CHOLLEY ( Lycée Victor HUGO BESANCON) –
Mise en page internet Emmanuelle FRANCOIS –
Tous nos remerciements à Valérie FAURE, Andrée GOUGET, Christiane LONCHAMP, Frédéric MOREL et Fabrice PONCET du laboratoire d’accueil

Présentation : Ce site offre un ensemble de photographies et documents obtenus lors d’une visite des laboratoires de cytogénétique de la faculté de médecine et de l’hôpital de Besançon.

Mots-clés : ADN, FISH, électrophorèse, séquençage

Public visé : Enseignants de lycée, terminale S spécialité et enseignement obligatoire

Objectif principal : Montrer quelques unes des manipulations courantes réalisées dans des laboratoires de recherche et d’analyses médicales

 

L’extraction du matériel génétique

Les techniques d’obtention de l’ADN peuvent être réalisées à partir de différents types de cellules ( peau, globules blancs, moelle osseuse, cellules fœtales…) . Dans le cas d’un prélèvement sanguin, les globules rouges subissent une hémolyse, puis la centrifugation permet de récupérer un culot de globules blancs sur lesquels s’effectue le prélèvement d’ADN . On obtient une méduse d’ADN.

 

Hémolyse de sang	Liquide amniotique
Méduse d’ADN
	Un peu d’histoire en quelques dates…En 1888, Waldeyer met en évidence les chromosomes En 1903, SUTTON énonce la théorie chromosomique de l’hérédité En 1920, Morgan reprend la théorie des chromosomes porteurs des gènes de l’hérédité En 1953, Watson et Crick découvre la structure en double hélice de la molécule d’ADN Depuis 1955, on sait que chaque cellule somatique humaine contient 46 chromosomes Dans le courant des années 1970, les techniques génétiques permettent d’isoler et d’analyser certains gènes En 1990, une première tentative de thérapie génique est réalisée.

 

 

Les apports de la FISH

La FISH ou “Fluorescence In Situ Hybridation” est fondée sur l’utilisation de marqueurs génétiques, séquence d’ADN de composition connue spécifique d’un gène (ou d’un groupements de gènes) repérée par un marqueur fluorescent . Ces marqueurs génétiques appelés encore sondes moléculaires s’hybrident avec l’ADN . L’hybridation ne peut se réaliser qu’entre une sonde monobrin et une portion d’un brin d’ADN portant la séquence complémentaire (les monobrins sont obtenus par chauffage).

Voici quelques résultats obtenus avec cette technique…

 

Multifish non classée	Multifish classée
Exemple de marquage sur un noyau interphasique (en bas à droite) et sur des chromosomes métaphasiques non classés	Exemple de marquage sur des chromosomes métaphasiques classés

 

Mise en évidence d’une délétion sur le chromosome 15

La paire chromosomique visible en FISH présente le chromosome de gauche replié ce qui rend l’observation plus délicate L’absence d’une double fluorescence sur le chromosome de gauche (replié) indique la présence d’une délétion difficilement détectable avec certitude par les méthodes traditionnelles de coloration

 

FISH sur spermatozoïdes
	Trois sondes moléculaires fluorescentes sont disponibles ici (sonde marquant le chromosome 8 fluorescent en rouge, sonde identifiant les gonosomes X et Y  respectivement bleue et jaune) Cette technique appliquée sur des spermatozoïdes afin de calculer la fréquence des anomalies numériques, permet de voir ci-contre la présence d’un spermatozoïde porteur d’un chromosome X et d’un chromosome Y

 

 

Mise en évidence d’une translocation équilibrée
	Hybridation sur une métaphase. La technique révèle la fusion de 2 chromosomes acrocentriques.

 

L’électrophorèse de séquences d’ADN

L’électrophorèse correspond à la migration dans un champ électrique de molécules chargées négativement. Le déplacement est d’autant plus rapide que la charge électrique est plus forte et la messe moléculaire plus faible. Cette technique permet de séparer des fragments d’ADN avec une discrimination maximale de 10 paires de bases.

 

Coulage du gel d’agarose liquide sur des broches créant des puits de dépôt de séquences d’ADN	Dépôt d’une séquence d’ADN de taille connue ( 249kb)
Détail du dépôt de la séquence additionnée de BET ( bromure d’éthidium)ayant des propriétés de fluorescence aux U.V	Résultat de l’électrophorèse après révélation aux ultraviolets

 

Le séquençage de l’ADN

La détermination de la succession des bases azotées constituant une séquence d’ADN ou séquençage de l’ADN se réalise grâce à un séquenceur recevant une séquence purifiée d’ADN sur laquelle sont identifiées les bases.

 

Séquenceur d’ADN

1 : gel de polyacrylamide recevant une séquence d’ADN purifiée obtenu par électrophorèse Le séquenceur permet à la différence de l’électrophorèse de séparer la ou les séquence(s) base par base et d’identifier ces bases grâce à un faisceau laser

 

Un exemple de séquençage d’un fragment d’ADN

Quatre couleurs sont affectées aux quatre bases de l’ADN, chaque pic représente la détection d’une de ces bases par le faisceau laser